黄曲霉素试剂盒使用说明书

黄曲霉素（AF）酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

1 使用目的：

本试剂盒用于检测饲料和谷物中黄曲霉素（AF）含量。

2 实验原理

本试剂盒采用直接竞争 ELISA 方法，在微孔板包被有黄曲霉素（AF）偶联抗原，加入黄曲霉素（AF）标准品或样品，游离黄曲霉素（AF）与微孔条上预包被的黄曲霉素偶联抗原互相竞争抗黄曲霉素（AF）抗体酶标记物，用 TMB 底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 波长下进行检测，吸光值与样品中黄曲霉素（AF）含量成反比，通过标准曲线计算样品中黄曲霉素（AF）的含量。

3 试剂盒组成

• 预包被的黄曲霉素（AF）偶联抗原的可拆酶标板：1 块（12 孔×4 条）。

• 黄曲霉素（AF）标准品：6 瓶（1ml/瓶），含量分别是： 0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1 ng/ml。

• 抗 AF 抗体酶结合物：1 瓶（3ml）。

• 显色液 A：1 瓶（3ml）。

• 显色液 B：1 瓶（3ml）。

• 终止液：1 瓶（3ml），2M 硫酸。

• 样本稀释液：1 瓶（10×,   3ml），用于样品稀释用。

• 浓缩洗涤液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。

• 说明书一份。

• 需要而未提供的材料

4.1 设备

4.1.1波长450nm酶标仪。4.1.2粉碎机。4.1.3量筒。4.1.4振荡器。4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相当的滤纸。

4.1.7微量移液器。

4.2 试剂

4.2.1去离子水或蒸馏水。

4.2.2 甲醇。

• 贮存

• 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻

• 未用完的微孔板应该密封干燥保存

6 注意事项

• 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。

• 不要使用过期试剂盒。

1

• 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。

• 标准品中含有黄曲霉素（AF），使用时应特别注意，操作时应带手套。

• 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。

• 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。

• 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
• 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果

• 混合试剂时应避免起泡。

7 工作液准备

7.1黄曲霉素（AF）标准品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml

• 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用

• 样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用

• 显色剂：已备用，避免光线直照

• 反应终止液：已备用

8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则

会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2强力振荡3分钟

8.3用Whatman 滤纸过滤

8.4取25µl处理后的样品，加入25µl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）

9 酶免分析步骤

9.1 实验须知

• 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保证回温充分，否则影响检测的度和准确度。
• 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存

• 请不要改变分析程序

• 请使用的微量移液器

• 操作一旦开始，请不要中断任何程序

• ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作

• 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样

• 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面

9.2 分析步骤

• 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测

• 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存

• 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)

• 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ ml标准品溶液

• 在各标准孔中加入50µl的标准品溶液

• 在各样品孔中加入50µl样品溶液

• 在所有孔中加入50µl的抗黄曲霉素（AF）抗体酶结合物

• 轻轻晃动反应板几秒钟。

9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）

9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液体。

2

9.4 反应

• 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加 50µl显色液B；轻微晃动反应板使之*混匀

• 37℃温浴10min

• 每孔中加入50µl终止液，混匀

• 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。

10 结果计算

10.1定量分析

10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以*个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值

10.1.2以黄曲霉素（AF）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为黄曲霉素（AF）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中黄曲霉素（AF）浓度C（ng/ml）10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释

倍数。

10.2 半定量测定

10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光

度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色

深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

11 特异性

物质 交叉反应

黄曲霉素B1 100% 黄曲霉素B2 80% 黄曲霉素G1 75% 黄曲霉素G2 30%

12 试剂盒参数

本试剂盒检测下限为0.1ppb B0吸光度*值应大于1.0

试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。

13 标准曲线模式（仅供参考）

试 剂 盒 提 供 的 标 准 曲 线 范 围 为 0.1ng/ml~8.1ng/ml 。

3

14 分析限制

本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。

黄曲霉素（AF）酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

1 使用目的：

本试剂盒用于检测饲料和谷物中黄曲霉素（AF）含量。

2 实验原理

本试剂盒采用直接竞争 ELISA 方法，在微孔板包被有黄曲霉素（AF）偶联抗原，加入黄曲霉素（AF）标准品或样品，游离黄曲霉素（AF）与微孔条上预包被的黄曲霉素偶联抗原互相竞争抗黄曲霉素（AF）抗体酶标记物，用 TMB 底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在 450nm 波长下进行检测，吸光值与样品中黄曲霉素（AF）含量成反比，通过标准曲线计算样品中黄曲霉素（AF）的含量。

3 试剂盒组成

• 预包被的黄曲霉素（AF）偶联抗原的可拆酶标板：1 块（12 孔×4 条）。

• 黄曲霉素（AF）标准品：6 瓶（1ml/瓶），含量分别是： 0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1 ng/ml。

• 抗 AF 抗体酶结合物：1 瓶（3ml）。

• 显色液 A：1 瓶（3ml）。

• 显色液 B：1 瓶（3ml）。

• 终止液：1 瓶（3ml），2M 硫酸。

• 样本稀释液：1 瓶（10×,   3ml），用于样品稀释用。

• 浓缩洗涤液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。

• 说明书一份。

• 需要而未提供的材料

4.1 设备

4.1.1波长450nm酶标仪。4.1.2粉碎机。4.1.3量筒。4.1.4振荡器。4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相当的滤纸。

4.1.7微量移液器。

4.2 试剂

4.2.1去离子水或蒸馏水。

4.2.2 甲醇。

• 贮存

• 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻

• 未用完的微孔板应该密封干燥保存

6 注意事项

• 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。

• 不要使用过期试剂盒。

1

• 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。

• 标准品中含有黄曲霉素（AF），使用时应特别注意，操作时应带手套。

• 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。

• 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。

• 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
• 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果

• 混合试剂时应避免起泡。

7 工作液准备

7.1黄曲霉素（AF）标准品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml

• 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用

• 样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用

• 显色剂：已备用，避免光线直照

• 反应终止液：已备用

8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则

会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2强力振荡3分钟

8.3用Whatman 滤纸过滤

8.4取25µl处理后的样品，加入25µl样本稀释液于反应孔中（样本稀释倍数为2）

9 酶免分析步骤

9.1 实验须知

• 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存注：一定保证回温充分，否则影响检测的度和准确度。
• 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存

• 请不要改变分析程序

• 请使用的微量移液器

• 操作一旦开始，请不要中断任何程序

• ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作

• 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样

• 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面

9.2 分析步骤

• 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测

• 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存

• 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)

• 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ ml标准品溶液

• 在各标准孔中加入50µl的标准品溶液

• 在各样品孔中加入50µl样品溶液

• 在所有孔中加入50µl的抗黄曲霉素（AF）抗体酶结合物

• 轻轻晃动反应板几秒钟。

9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）

9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液体。

2

9.4 反应

• 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加 50µl显色液B；轻微晃动反应板使之*混匀

• 37℃温浴10min

• 每孔中加入50µl终止液，混匀

• 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。

10 结果计算

10.1定量分析

10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以*个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值

10.1.2以黄曲霉素（AF）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为黄曲霉素（AF）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中黄曲霉素（AF）浓度C（ng/ml）10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释

倍数。

10.2 半定量测定

10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光

度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色

深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

11 特异性

物质 交叉反应

黄曲霉素B1 100% 黄曲霉素B2 80% 黄曲霉素G1 75% 黄曲霉素G2 30%

12 试剂盒参数

本试剂盒检测下限为0.1ppb B0吸光度*值应大于1.0

试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。

13 标准曲线模式（仅供参考）

试 剂 盒 提 供 的 标 准 曲 线 范 围 为 0.1ng/ml~8.1ng/ml 。

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14 分析限制

本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。