细胞/组织活性高尔基体粗提分离试剂盒产品说明书

YIJI细胞/组织活性高尔基体粗提分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI细胞/组织活性高尔基体粗提分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理，差速以及等密度离心方法，从动物细胞或软组织中分离出完整的活性高尔基体细胞器组分的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物细胞或组织（人体、老鼠、兔子等）样品中活性高尔基体的制备。可以被用于受体循环、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗体释放机制等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量高。

技术背景

高尔基体（Golgi apparatus或Golgi body），又称为高尔基复合体（Golgi complex），是大多数真核细胞的细胞器组分，由40至100扁平片层或称为小池（cisternae）堆叠成内膜系统（endomembrane system），分成正侧或内侧网络（cis-Golgi network）、近内中间网络（medial-Golgi）、内腔网络（endo-Golgi）、外侧或反侧网络等（trans-Golgi）细胞内小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互连接的网络结构，其主要功能在于由内侧网络接受内质网囊泡中的蛋白质和脂类等生物大分子，处理（修饰、分类）和组装后，由外侧网络转运分泌到目标位置。同时也是合成蛋白聚糖（proteoglycan）和碳水化合物的重要场所。高尔基体的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：*，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，可以通过等密度离心获得高尔基体。 

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   100毫升

YIJI裂解液（Reagent B）    30毫升

YIJI分离液A（Reagent C）    30毫升

YIJI分离液B（Reagent D）    30毫升

YIJI保存液（Reagent E）    70毫升

YIJI活性液（Reagent F）   200微升

产品说明书 1份

保存方式

保存YIJI活性液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（YJ12028）或PBS缓冲溶液（YJ12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（YJ12052）：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

8毫升超速离心管：用于超高速离心的容器

4℃（微型）台式离心机：用于样品制备

4℃超速离心机：用于样品制备

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

平式摇荡仪：用于混匀

3号针筒和18号针头：用于收集样品

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的YIJI活性液（Reagent F）冻融，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

细胞样品

• 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 重复实验步骤2一次
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
• 置入37℃培养箱3分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
• 分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入一个15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的3毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI活性液（Reagent F）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心15分钟，速度为3000g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
• 移取3毫升的YIJI分离液A（Reagent C）到8毫升超速离心管 
• 小心加入3毫升的YIJI分离液B（Reagent D）在YIJI分离液A（Reagent C）的上面，避免震动
• 轻轻加入2毫升上述高尔基体混匀液在YIJI分离液B（Reagent D）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心4小时，速度为100000g
• 小心取出超速离心管：可见样品和YIJI分离液B（Reagent D）交界处棕色或乳黄色样品带
• 小心收集高尔基体样品带到8毫升超速离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）
• 加入6毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放进4℃超速离心机离心30分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液（注意：为白色或絮状沉淀，较为松散）
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混匀
• 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
• 放进－70℃冰箱里保存
• 组织样品
• 手术取出动物组织，避免或去除脂肪组织，秤重以确定1克组织重量（实验前使动物空腹12至24小时） 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入5毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的3毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 加入20微升YIJI活性液（Reagent F）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
• 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心15分钟，速度为3000g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
• 移取3毫升的YIJI分离液A（Reagent C）到8毫升超速离心管 
• 小心加入3毫升的YIJI分离液B（Reagent D）在YIJI分离液A（Reagent C）的上面，避免震动
• 轻轻加入2毫升上述高尔基体混匀液在YIJI分离液B（Reagent D）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心4小时，速度为100000g
• 小心取出超速离心管：可见样品和YIJI分离液B（Reagent D）交界处棕色或乳黄色样品带
• 小心收集高尔基体样品带到8毫升超速离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）
• 加入6毫升YIJI保存液（Reagent E）
• 放进4℃超速离心机离心30分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液（注意：为白色或絮状沉淀，较为松散）
• 加入500微升YIJI保存液（Reagent E），混匀
• 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
• 放进－70℃冰箱里保存

注意事项

• 本产品为10次（1克动物组织或5 X 107细胞）操作
• 操作时，须戴手套
• 操作时，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI分离液A/B（Reagent C/D）和YIJI保存液（Reagent E）
• 样品处理避免使用EDTA，否则影响分离效果
• 所有操作均须在4℃或以下状态进行
• 建议使用足够的样品量
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 根据超速离心管的大小调整YIJI分离液A/B（Reagent C/D）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
• 通常5 X 107细胞或1克动物组织的高尔基体含量为15微克蛋白

11． 本产品所获得的高尔基体纯度和产量zui为理想

12． 高尔基体的标志蛋白是UDP半乳糖转移酶（UDP-glactosyl transferase）；建议使用YIJI纯化高尔基体UDP半乳糖转移酶（UDP-glactosyl transferase）活性比色法定量检测试剂盒－YJ50414.3

• 本公司提供系列亚细胞结构分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离的高尔基体维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶