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技术文章

组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书

点击次数:2063 发布时间:2015-01-27

YIJI组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

YIJI组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物,IKKβ激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下,受到IKKβ酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化,以分析组织裂解样品中IKKβ特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中IKKβ激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

技术背景

B细胞κ轻链多肽基因促动子抑制剂激酶复合物(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cellskinase complex;IκB kinase;IKKEC 2.7.11.10),是NF-κB信号通路中的成员之一,由3个亚体构成:IKKα,又称为IKK1CHUKconserved helix-loop-helix ubiquitous kinase;IKKβ,又称为IKK2或IKBKB;IKKγ,又称为NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4,属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属中鸟苷酸结合蛋白偶联受体激酶guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase;GRK)亚系成员之一。多基因GRK亚系由6个成员构成,分成3类:包括GRK1(视网膜色素激酶家系;rhodopsin kinase)、GRK2/3β肾上腺素能受体激酶;β-adrenergic receptor kinase)以及IKK/5/6IKK激酶)。其中G蛋白偶联受体激酶4至少有4种变异体:IKKα、β、γδ,在睾丸组织中高度表达。IKK使G蛋白偶联受体,例如多巴胺等去敏化(desensitization)、以及精子授精等有关。其目标蛋白为活化的G-蛋白偶联受体蛋白,进行磷酸化后,抑制其功能。功能异常将导致遗传性或获得性高血压等疾病。其磷酸化目标序列为RRREEEEESAAA基于底物RRREEEEESAAAIKKβ激酶敏感性抑制剂5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺((5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide)存在与否的情况下,受到IKKβ激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其吸光峰值的变化340nm,来定量分析IKKβ的特异活性其反应方式为:

产品内容

YIJI清理液(Reagent A)   毫升

YIJI裂解液(Reagent B)   毫升

YIJI缓冲液(Reagent C)  毫升

YIJI酶促液(Reagent D)  微升

YIJI反应液(Reagent E)  微升

YIJI底物液(Reagent F)   微升

YIJI阴性液(Reagent G)  微升

YIJI专性液(Reagent H)  微升

产品说明书     1份

保存方式

保存YIJI清理液(Reagent A)4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6

用户自备

IKKβ激酶:用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

(微型)台式离心机:用于组织预处理

比色皿或酶标板:用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析

实验步骤

  • 待测样品准备
  • 手术取出动物组织,并秤重500毫克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A清洗
  • (选择步骤)抽去清理液
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐隔夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(zui快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入置于冰槽里的xx微升YIJI裂解液(Reagent B 
  • 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
  • 放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用
  • 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g 
  • 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YJ30030.1
  • 放进-70的冰箱里保存或置于冰槽里备用
  • 测定准备
  • 准备好待测样品(例如组织裂解悬液等),置于冰槽里 
  • 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
  • YIJI缓冲液(Reagent C室温下均衡温度
  • 背景对照测定
  • 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入xx微升YIJI阴性液(Reagent G
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟
  • 样品总活性测定
  • 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入5微升待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白;样品须溶解
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟 
  • 样品非特异活性测定

检测开始前,移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到1.5毫升离心管,分别加入xx微升YIJI专性液(Reagent H)待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

  • 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F 
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟
  • 计算样品活性
  • 样品总活性和非特异活性计算

2)样品特异活性计算

七、酶标板测定

1)样品总活性测定

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到96孔板中
  • 分别加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升YIJI底物液(Reagent F
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 30℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入xx微升YIJI阴性液(Reagent G待测样品(50微克组织裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
  • 活性计算:
  • 样品非特异活性测定

检测开始前,移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到1.5毫升离心管,分别加入xx微升YIJI专性液(Reagent H)待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

  • 96孔酶标板上做好相应标记:待测样品
  • 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到96孔板中
  • 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F 
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 30℃温度下孵育3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
  • 活性计算:
  • 样品特异活性计算

八、抑制剂筛选

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品
  • 按下表加入试剂,进行样品预处理

内容物

空背景对照

样本背景

完全酶活性

待测抑制剂酶活性

YIJI缓冲液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

YIJI阴性液(Reagent G)

xx微升

xx微升

xx微升

——

待测抑制剂

——

xx微升

――

xx微升

用户自备的纯化酶

——

——

xx微升(1毫单位)

xx微升(1毫单位)

96孔板每孔总量

空背景对照

xx微升)

样本背景孔

xx微升)

完全活性

xx微升)

待测抑制剂样品

xx微升)

轻轻摇动酶标板,混匀放进30培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作

  • 分别移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C新的96孔板的所有
  • 分别加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升YIJI底物液(Reagent F 
  • 轻轻摇动酶标板
  • 在30温度下孵育3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 即刻放进30酶标仪检测:测读30分钟
  • 抑制活性计算:

注意事项

  • 本产品为25次操作,包括背景操作
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
  • 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
  • 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YJ30030.1) 
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 可以使用IKKβ抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照
  • IKKβ活性单位浓度定义:在30温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

本产品经鉴定性能稳定

本产品经鉴定检测敏感

关于订购详情或,、来函、传真或电邮――

上海一基实业有限公司

上海市浦东新区张扬北路5972号

200137

2851331337@.com

主页:www.yijisy.com

 
公司名称:上海一基实业有限公司 公司地址:上海浦东新区张杨北路5972号 邮政编码:200137 
联系人:张嘉彬 联系电话:021-60526763  传真号码:021-50190009 公司网址:www.yijisy.com
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