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产品分类YIJI组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
YIJI组织IKKβ激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物,在IKKβ激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下,受到IKKβ磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化,以分析组织裂解样品中IKKβ特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或*纯化酶样品中IKKβ激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。
技术背景
B细胞κ轻链多肽基因促动子抑制剂激酶复合物(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells,kinase complex;IκB kinase;IKK;EC 2.7.11.10),是NF-κB信号通路中的成员之一,由3个亚体构成:IKKα,又称为IKK1或CHUK(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase);IKKβ,又称为IKK2或IKBKB;IKKγ,又称为NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4,属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属中鸟苷酸结合蛋白偶联受体激酶(guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase;GRK)亚系成员之一。多基因GRK亚系由6个成员构成,分成3类:包括GRK1(视网膜色素激酶家系;rhodopsin kinase)、GRK2/3(β肾上腺素能受体激酶;β-adrenergic receptor kinase)以及IKK/5/6(IKK激酶)。其中G蛋白偶联受体激酶4至少有4种变异体:IKKα、β、γ、δ,在睾丸组织中高度表达。IKK使G蛋白偶联受体,例如多巴胺等去敏化(desensitization)、以及精子授精等有关。其目标蛋白为活化的G-蛋白偶联受体蛋白,进行磷酸化后,抑制其功能。其功能异常将导致遗传性或获得性高血压等疾病。其磷酸化目标序列为RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA,在IKKβ激酶敏感性抑制剂5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺((5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide)存在与否的情况下,受到IKKβ激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析IKKβ的特异活性。其反应方式为:
产品内容
YIJI清理液(Reagent A) 毫升
YIJI裂解液(Reagent B) 毫升
YIJI缓冲液(Reagent C) 毫升
YIJI酶促液(Reagent D) 微升
YIJI反应液(Reagent E) 微升
YIJI底物液(Reagent F) 微升
YIJI阴性液(Reagent G) 微升
YIJI专性液(Reagent H) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月
用户自备
IKKβ激酶:用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管:用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器
(微型)台式离心机:用于组织预处理
比色皿或酶标板:用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析
实验步骤
检测开始前,移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升YIJI专性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
2)样品特异活性计算
七、酶标板测定
1)样品总活性测定
检测开始前,移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升YIJI专性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
八、抑制剂筛选
内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | *酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
YIJI缓冲液(Reagent C) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
YIJI阴性液(Reagent G) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待测抑制剂 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用户自备的纯化酶 | —— | —— | xx微升(1毫单位) | xx微升(1毫单位) |
96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 (xx微升) | 样本背景孔 (xx微升) | *活性孔 (xx微升) | 待测抑制剂样品孔 (xx微升) |
轻轻摇动酶标板,混匀,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 |
注意事项
质量标准
本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定检测敏感
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