细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒

YIJI细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物，在CDK6/CYCLIN D激酶抑制剂的存在下，受到CDK4/CYCLIN D磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CDK4/CYCLIN D特异活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中CDK4/CYCLIN D激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

细胞周期素依赖性激酶4（cyclin dependent kinase 4；CDK4；EC 2.7.11.22），又称为皮肤恶性黑色素瘤因子3（cutaneous malignant melanoma 3；CMM3），属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其与酵母细胞的cdc28和cdc2高度进化保留。细胞周期素依赖性激酶4的催化亚体，在细胞周期素D和p16的调节下，在细胞周期G1-S期作用，允许细胞通过G1期，达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。P16INK4a 是CDK4激酶的抑制剂。成视网膜细胞瘤（retinoblastoma；Rb）基因产物是CDK4激酶的磷酸化目标蛋白。细胞周期素依赖性激酶4异常将导致恶性肿瘤等。CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化目标序列为RPPTLSPIPHIPR。基于底物RPPTLSPIPHIPR，在ATP和CDK6/CYCLIN D抑制剂Ro 318220的存在下，受到CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析细胞周期素依赖性激酶4/细胞周期素D的特异活性。其反应方式为：

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI缓冲液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反应液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）   微升

YIJI阴性液（Reagent G）  微升

产品说明书     1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

CDK4/CYCLIN D激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

比色皿或酶标板：用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析

实验步骤

• 待测样品准备
• 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
• 测定准备
• 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
• 背景对照测定
• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
• 样品测定
• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
• 计算样品活性
• 酶标板测定
• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板中
• 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动酶标板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

七、抑制剂筛选

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景、*活性和待测抑制剂样品
• 按下表加入试剂，进行样品预处理

• 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 轻轻摇动酶标板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
• 抑制活性计算：

注意事项

• 本产品为25次操作，包括背景操作
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 
• 样品须澄清，至关重要 
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
• 光谱测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1） 
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 可以使用CDK4/CYCLIN D抑制剂二氨基氧吖啶氢硫酮【1,4-Dimethoxyacridine-9(10H)-thione）；IC50＝200纳摩尔】或Arcyriaflavin A（IC50=59纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
• CDK4/CYCLIN D激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感