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技术文章

细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒

点击次数:1988 发布时间:2014-12-17

YIJI细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

YIJI细胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物,在CDK6/CYCLIN D激酶抑制剂的存在下,受到CDK4/CYCLIN D磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化,以分析细胞裂解样品中CDK4/CYCLIN D特异活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中CDK4/CYCLIN D激酶的特异活性定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

技术背景

细胞周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4;CDK4EC 2.7.11.22),又称皮肤恶性黑色素瘤因子3(cutaneous malignant melanoma 3CMM3,属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一。其与酵母细胞的cdc28和cdc2高度进化保留。细胞周期素依赖性激酶4的催化亚体,在细胞周期素D和p16的调节下,在细胞周期G1-S期作用,允许细胞通过G1期,达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等P16INK4a CDK4激酶的抑制剂。成视网膜细胞瘤retinoblastomaRb)基因产物是CDK4激酶的磷酸化目标蛋白。细胞周期素依赖性激酶4异常将导致恶性肿瘤等。CDK4/CYCLIN D激酶磷酸化目标序列为RPPTLSPIPHIPR基于底物RPPTLSPIPHIPR,在ATP和CDK6/CYCLIN D抑制剂Ro 318220的存在下,受到CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸reduced nicotinamide adenine dinucleotideNADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析细胞周期素依赖性激酶4/细胞周期素D的特异活性其反应方式为:

产品内容

YIJI清理液(Reagent A)   毫升

YIJI裂解液(Reagent B)   毫升

YIJI缓冲液(Reagent C)  毫升

YIJI酶促液(Reagent D)  微升

YIJI反应液(Reagent E)  微升

YIJI底物液(Reagent F)   微升

YIJI阴性液(Reagent G)  微升

产品说明书     1份

保存方式

保存YIJI清理液(Reagent A)在4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月

用户自备

CDK4/CYCLIN D激酶:用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于细胞预处理

比色皿或酶标板:用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析

实验步骤

  • 待测样品准备
  • 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 106细胞)
  • 小心加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化
  • 加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升YIJI裂解液(Reagent B,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用YIJI  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YJ30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作
  • 测定准备
  • 准备好待测样品(例如细胞裂解悬液等),置于冰槽里 
  • 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
  • 背景对照测定
  • 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入xx微升YIJI阴性液(Reagent G
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟
  • 样品测定
  • 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent F
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白;样品须溶解
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟
  • 计算样品活性
  • 酶标板测定
  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C到96孔板中
  • 分别加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升YIJI底物液(Reagent F
  • 轻轻摇动96孔酶标板
  • 30℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入xx微升YIJI阴性液(Reagent G待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
  • 活性计算:

七、抑制剂筛选

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品
  • 按下表加入试剂,进行样品预处理

内容物

空背景对照

样本背景

完全酶活性

待测抑制剂酶活性

YIJI缓冲液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

YIJI阴性液(Reagent G)

xx微升

xx微升

xx微升

——

待测抑制剂

——

xx微升

――

xx微升

用户自备的纯化酶

——

——

xx微升(1毫单位)

xx微升(1毫单位)

96孔板每孔总量

空背景对照

xx微升)

样本背景孔

xx微升)

完全活性

xx微升)

待测抑制剂样品

xx微升)

轻轻摇动酶标板,混匀放进30培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作

  • 分别移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C新的96孔板的所有
  • 分别加入xx微升YIJI酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升YIJI反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升YIJI底物液(Reagent F 
  • 轻轻摇动酶标板
  • 在30温度下孵育3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 即刻放进30酶标仪检测:测读30分钟
  • 抑制活性计算:

注意事项

  • 本产品为25次操作,包括背景操作
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
  • 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
  • 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YJ30030.1) 
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 可以使用CDK4/CYCLIN D抑制剂二氨基吖啶硫酮1,4-Dimethoxyacridine-9(10H)-thione);IC50=200纳摩尔】或Arcyriaflavin A(IC50=59纳摩尔)作为抑制剂对照或阴性对照
  • CDK4/CYCLIN D激酶活性单位浓度定义:在30温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感

 
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