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技术文章

线粒体呼吸链复合物 V 活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)

点击次数:2451 发布时间:2014-03-31

YIJI 线粒体呼吸链复合物 V 活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
YIJI 线粒体呼吸链复合物 V(F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶)活性光谱法定量检测试剂是一种旨在使用丙
酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定与 ATP 合成对应的 ATP 水解产生 ADP 过程中,伴随的
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后吸光峰值的降低,即采用光谱法测定样品中酶活性的
而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品(动
物、人体、酵母)以及细胞或组织裂解悬液样品的 F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶的特异性活性检测。可用于心
肌、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,
操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
技术背景
线粒体呼吸链复合物V,通常称为ATP合成酶(ATP synthase) F型ATP酶 type ATPase)、(F和F1F0 ATP酶(F1F0
ATPase),是线粒体氧化磷酸化的*反应。其分子量为500KD,含有十六个亚单位,其中两个:ATP酶6
和8为线粒体DNA编码的。ATP酶主要有两个结构域:F0为质子通道,由几个膜蛋白构成,包括a、b、c、d、
e、F6、A6L、OSCP(oligomycin sensitive conferring protein)等;和F1催化活性结构域,由水溶性的α3β
3γδε蛋白构成。其zui特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。复合物V的主要功能在于产生大部分
细胞所需的能量ATP。ATP的合成需要线粒体内膜电子传递到氧分子时,呼吸链蛋白所产生的质子梯度变化。
质子通过F0结构域传递到基质,激活F1催化活性结构域,促使ATP合成。该酶异常会导致心肌和神经系统
疾病。基于ATP,在寡霉素参与下,受到F1F0 ATP酶的水解,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)
和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide
adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),
产生的吸光峰值的变化(340nm),来定量分析F1F0 ATP酶活性。其反应系统为:
产品内容
YIJI 缓冲液(Reagent A)
YIJI 反应液(Reagent B)
YIJI 阴性液(Reagent C)
YIJI 底物液(Reagent D)
YIJI 专性液(Reagent E)
产品说明书
毫升
毫升
毫升
微升
微升
1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;YIJI 反应液(Reagent B),避免光照,有效保证 6 月
用户自备
比色皿:用于光谱分析的容器
1

分光光度仪:用于光谱分析
培养箱:用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;YIJI 反应液(Reagent B)注
意避光。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如纯化线粒体样品等),置于冰槽里(注意:检测前溶解线粒体;参见注意事项 4)
2. 设定好分光光度仪(温度为 30℃):波长为 340nm,间隔 30 秒,读数 11 次(共 5 分钟),并置零
二、 背景对照测定
1. 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 YIJI 反应液(Reagent B)
3. 加入 xx 微升 YIJI 底物液(Reagent D)
4. 放进 30℃培养箱里孵育 3 分钟
5. 加入 xx 微升 YIJI 阴性液(Reagent C)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 1 分钟或 5 分钟
三、 样品总活性测定
1. 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 YIJI 反应液(Reagent B)
3. 加入 xx 微升 YIJI 底物液(Reagent D)
4. 放进 30℃培养箱里孵育 3 分钟
5. 加入 100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白;样品须溶解;参见注意事项 4)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 1 分钟或 5 分钟
四、 样品非特异活性测定
实验开始前,移取 100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白;样品须溶解;参见注意事项 4)到 1.5
毫升离心管,加入 xx 微升 YIJI 专性液(Reagent E),混匀后,放进 30℃培养箱里孵育 15 分钟。然
后置于冰槽里备用
1. 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入 xx 微升 YIJI 反应液(Reagent B)
3. 加入 xx 微升 YIJI 底物液(Reagent D)
4. 放进 30℃培养箱里孵育 3 分钟
2

5. 加入 120 微升上述预处理的待测样品
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340 波长读数 0 分钟 -340 波长读数 1 分钟或 5 分钟
五、 计算样品活性
1)样品活性(总活性和非特异活性)
【(样品读数-背景读数)X 1(体系容量;毫升)X 样品稀释倍数】÷【0xx(样品容量;毫升)Xxx(毫
摩尔吸光系数 X 1 或 5(反应时间,分钟)】=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔 NADH/分钟
2)样品特异活性
样品总活性测定-样品非特异活性测定=样品特异活性
注意事项
1. 本产品为 21 次操作(10 个样本),包括 1 次背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需 1 次
4. 线粒体样品检测前,须溶解;建议超声处理(20 秒 X 3 循环;50%功率)或冻存融解(-70℃至 37℃)
循环 3 次或使用 YIJI 线粒体溶解试剂盒-GMS10018
5. 建议线粒体悬液使用 0.25 M SUCROSE 和 2 mM EDTA,pH9.0;忌用磷酸缓冲溶液
6. 建议使用线粒体裂解悬液,而不是细胞裂解悬液。如果使用细胞裂解悬液,*须澄清;第二须加 50
微克
7. 加入样品后 3 秒内即刻光谱测定
8. 反应 1 分钟后光谱测定值趋于稳定;测定值由高到低变化;测定可以持续 5 分钟
9. 测定值由高到低变化,即 0 分钟测定读数高于 1 分钟或 5 分钟测定读数,表明有酶活性
10.光谱测定后,比色皿须清洗彻底
11.建议待测样本线粒体蛋白浓度为 10 微克/100 微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样
本量;注意计算公式的调整(本公司提供 YIJI 线粒体溶解试剂盒 GMS10018 为后续的线粒体蛋
白浓度测定的预处理试剂盒和 YIJI Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 GMS30030.1)
12.样品特异活性是指寡霉素敏感的 ATP 合成酶,去除其它干扰因素(例如复合物 I/II/III/IV 等)
13.线粒体呼吸链复合物 V 酶活性单位浓度定义:在 30℃温度下,pH 7.5 条件下,每分钟内能够氧化 1 微
摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
14.本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测准确

 
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