YIJI 线粒体呼吸链复合物 IV 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

YIJI 线粒体呼吸链复合物 IV 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途
YIJI 线粒体呼吸链复合物 IV（细胞色素 C－氧化还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过
细胞色素 C 氧化酶反应系统中还原性细胞色素 C 氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性
的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体（动
物、人体、酵母等）呼吸链复合物 IV 的活性检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简捷，性能
稳定。
技术背景
线粒体呼吸链复合物 IV （Mitochondria Complex IV），又称为细胞色素 C 氧化还原酶（cytochrome c
oxidoreductase）或细胞色素 C 氧化酶（Cytochrome c oxidase），存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通
过氧化磷酸化为细胞提供能量。呼吸链复合物 IV 是由 13 种不同的亚体构成的复合物，其中含有 2 个血红
素（heme）基团（a 和 a3）和 2 个铜原子，作为辅基（prosthetic groups）。呼吸链复合物 IV 的遗传变异导
致氧化磷酸化类疾病，包括阿茨罕默综合症和肿瘤等。基于底物还原型细胞色素 C（reduced cytochrome c），
受到呼吸链复合物 IV 的催化，转化为氧化型细胞色素 C（oxidized cytochrome c），在分光光度仪下，出现
吸光值的变化（550nm 波长），由此定量测定呼吸链复合物 IV 的活性。呼吸链复合物 IV 反应系统为：
产品内容
YIJI 缓冲液（Reagent A）
YIJI 反应液（Reagent B）
YIJI 稀释液（Reagent C）
YIJI 稳定液（Reagent D）
产品说明书
毫升
毫升
毫升
微升
1份
保存方式
YIJI 缓冲液（Reagent A）和 YIJI 稀释液（Reagent C）保存在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃
冰箱里；YIJI 反应液（Reagent B）避免光照；有效保证 6 月
用户自备
1.5 毫升离心管：用于反应液配制的容器
比色皿：用于比色的容器
分光光度仪：用于比色分析
实验步骤
1

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 YIJI 反应液（Reagent B）置入冰槽里融化，然后移出
xx 微升到新的 1.5 毫升离心管，加入 xx 微升 YIJI 稳定液（Reagent D），轻柔混匀后，室温下避光静
置 15 分钟（可见颜色变化），置于冰槽里，标记为 YIJI 反应工作液（注意：见注意事项 5），放在暗
室里。然后进行下列操作。
一、 测读准备
1． 准备好含有复合物 IV 的样品，置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪：温度 25℃，波长 550nm，间隔 10 秒，测读 7 次（共 60 秒），并置零或设置 0 秒
和 60 秒各测读 1 次
二、 背景对照测定
1． 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液（Reagent A）到新的 1 毫升比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 稀释液（Reagent C）
3． 上下倾倒数次，混匀
4． 室温下孵育 2 分钟
5． （选择步骤）放进分光光度仪，置零
6． （选择步骤）取出比色皿
7． 加入 xx 微升含有 YIJI 反应液（Reagent B）和 YIJI 稳定液（Reagent D）的 YIJI 反
应工作液
8． 上下倾倒数次，混匀
9． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0 秒读数－60 秒读数），正常读数差值为 0.001 至 0.005
三、 样品测定
1． 移取 xx 微升 YIJI 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升待测样品（注意：建议总量 2 微克线粒体蛋白）
3． 上下倾倒数次，混匀
4． 室温下孵育 2 分钟
5． （选择步骤）放进分光光度仪，置零
6． （选择步骤）取出比色皿
7． 加入 xx 微升含有 YIJI 反应液（Reagent B）和 YIJI 稳定液（Reagent D）的 YIJI 反
应工作液
8． 即刻上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0 秒读数－60 秒读数），通常活性读数差值为正数
四、 计算样品活性
【（样品读数－背景读数）X xx（体系容量；毫升）X 样品稀释倍数】÷【xx（样品容量；毫升）X xx（毫
摩尔吸光系数 X xx（反应时间，分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔细胞色素 C/分钟
2

注意事项
1． 本产品为 20 次操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 线粒体样品中忌用 DTT 和巯基乙醇等处理
4． 线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至 37℃）循环 3 次或使用 YIJI 线粒体溶解
试剂盒－GMS10018
5． 每增加 1 个样品，增加 YIJI 反应工作液为：YIJI 反应液（Reagent B） 微升＋YIJIxx
稳定液（Reagent D）1.5 微升，以此类推。配制反应工作液时，须根据样本数量配制实际工作液容量
6． 系统操作过程中，背景测定只需 1 次
7． 分光光度计波长严格设置在 550nm，误差 10nm 将不产生信号
8． 加样后 3 秒内进行比色测定
9． 比色测定后，比色皿须清洗*
10．背景空对照 0 秒读数通常 0.2 至 0.8 为理想状态
11．背景空对照的正常读数差值（0 秒－60 秒）通常为 0.001 至 0.005（正负即可）
12．样品 0 秒读数通常和背景空对照 0 秒读数一致
13．样本测定 60 秒读数低于 0 秒读数表明具有酶活性
14．线粒体呼吸链复合物 IV 酶活性单位浓度定义：在 25℃室温下，pH 7.0 的情况下，每单位酶在单位时
间内（每分钟）氧化 1 微摩尔的细胞色素 C
15．建议待测样本为线粒体裂解悬液，则蛋白浓度为 2 微克/100 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可
以增加或降低样本量（本公司提供 YIJI 线粒体溶解试剂盒 GMS10018 为后续的线粒体蛋白浓度
测定的预处理试剂盒和 YIJI Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 GMS30030.1）
16．如果使用细胞或组织裂解悬液，则蛋白浓度为 50 微克/100 微升
17．本公司提供系列线粒体研究产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感

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