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YIJI组织样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书(中文版)

更新时间:2014-03-11      浏览次数:2544


YIJI组织样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书(中文版)

主要用途

YIJI组织样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低,即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织(动物、人体、植物、昆虫等)裂解悬液中细胞色素C氧化酶的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

技术背景

细胞色素C氧化酶(Cytochrome c oxidase)存在于真核生物的细胞线粒体上,主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C(reduced cytochrome c),受到细胞色素C氧化酶的催化,转化为氧化型细胞色素C(oxidized cytochrome c),在分光光度仪下,出现吸光值的变化(550nm 波长),由此定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为:

             

产品内容

YIJI清理液(Reagent A)                                  毫升
YIJI裂解液(Reagent B)                                  毫升
YIJI缓冲液(Reagent C)                                  毫升
YIJI反应液(Reagent D)                                  毫升
YIJI稀释液(Reagent E)                                      毫升
YIJI稳定液(Reagent F)                                      微升
产品说明书                                                   1份

保存方式

保存YIJI清理液(Reagent A)、YIJI缓冲液(Reagent C)和YIJI稀释液(Reagent E)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃冰箱里;YIJI反应液(Reagent D)避免光照;有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管:用于反应液和样品制备的容器
15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
(微型)台式离心机:用于样品操作
比色皿:用于比色的容器
分光光度仪:用于比色分析

实验步骤
 
样品准备

手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量 
(选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
(选择步骤)加入适量的(500毫克组织需要xx毫升)YIJI清理液(Reagent A)清洗1次
移入到一个液氮冻存管
即刻放进液氮罐过ye
次日从液氮罐里取出,即刻(zui快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
放进一个15毫升锥形离心管
加入预冷的xx微升YIJI裂解液(Reagent B) 
转移到预冷的1.5毫升离心管
强力涡旋震荡30秒,充分混匀
置于冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用)
放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)
即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
 
测读准备

准备好待测样品,置于冰槽里融化 
设定好分光光度仪:温度25℃,波长550nm,间隔10秒,测读7次(共60秒),并置零或设置0秒和60秒各测读1次
测定开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的YIJI反应液(Reagent D)置入冰槽里融化,然后移出100微升到新的1.5毫升离心管,加入xx微升YIJI稳定液(Reagent F),轻柔混匀后,室温下避光静置至少15分钟(可见颜色变化),置于冰槽里,标记为YIJI反应工作液(注意:参见注意事项4),放在暗室里备用。然后进行下列操作。

背景对照测定

移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到新的1毫升比色皿
加入xx微升YIJI稀释液(Reagent E)
上下倾倒数次,混匀
室温下孵育2分钟
放进分光光度仪,置零
取出比色皿,加入xx微升含有YIJI反应液(Reagent D)和YIJI稳定液(Reagent F)的YIJI反应工作液
上下倾倒数次,混匀
即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(0秒读数-60秒读数),
样品测定

移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
加入100微升待测样品(注意:建议总量50微克总蛋白,且样品需澄清)
上下倾倒数次,混匀
室温下孵育2分钟
放进分光光度仪,置零
取出比色皿,加入xx微升含有YIJI反应液(Reagent D)和YIJI稳定液(Reagent F)的YIJI反应工作液
即刻上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(0秒读数-60秒读数),
计算样品活性


注意事项

本产品为20次操作,包括背景对照
操作时,须戴手套
样品制备中忌用DTT和巯基乙醇等处理
每增加1个样品,增加YIJI反应工作液为:YIJI反应液(Reagent D)50微升+YIJI稳定液(Reagent F)1.5微升,以此类推。配制反应工作液时,须根据样本数量配制实际工作液容量。
系统操作过程中,背景测定只需1次
分光光度计波长严格设置在550nm,误差10nm将不产生信号
加样后3秒内进行比色测定
比色测定后,比色皿须清洗*
背景空对照0秒读数通常0.2至0.8为理想状态
背景空对照的正常读数差值(0秒-60秒)通常为0.001至0.005(正负即可)
样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
样本测定60秒读数低于0秒读数表明具有酶活性
酶活性单位浓度定义:在25℃室温下,pH 7.0的情况下,每单位酶在单位时间内(每分钟)氧化1微摩尔的细胞色素C
建议待测样本总蛋白浓度为50微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,即60秒读数不变或为零,则可以增加或降低样本量(本公司提供YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
本公司提供系列细胞色素相关试剂产品

 
质量标准

本产品经鉴定性能稳定
本产品经鉴定检测敏感

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