YJIJ纯化线粒体膜通道孔（MPTP）比色法检测试剂盒产品说明书（中文版）

    YJIJ纯化线粒体膜通道孔（MPTP）比色法检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI纯化线粒体膜通道孔（MPTP）比色法检测试剂是一种旨在通过比色法检测线粒体的体积（膨胀性）变化，来实时分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膜通道孔活性的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。

技术背景

线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的诱导开放，显著改变线粒体的通透性，小于1500 D的溶质可以自由进出线粒体。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C的释放和线粒体膜电位的消失，触发细胞凋亡和坏死。而环胞霉素A （cyclosporin A；CsA）、氟比嗪（trifluoperazine）和氯化镁等则抑制膜通道孔诱导开放。使用分光光度仪（波长540nm或440nm）检测线粒体的体积（膨胀性）变化，来分析和观察线粒体膜通道孔开放状态，即线粒体膜通道孔开放，线粒体容积增大（线粒体膨胀），光散射性降低。 

产品内容

YIJI缓冲液（Reagent A）   5毫升

YIJI诱导液（Reagent B） 200微升

YIJI抑制液（Reagent C） 200微升

产品说明书   1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

比色皿或96孔板：用于线粒体比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于线粒体比色定量分析

实验步骤

实验开始前，开启并设定好分光光度仪或酶标仪（温度为25℃）：波长540nm或440nm，间隔30秒测读1次，持续10分钟至30分钟，并置零

• 诱导剂检测

• 准备好待测的纯化线粒体样品
• 移取20微升线粒体样品（总量为200微克）到比色皿或96孔板的对应孔里
• 加入170微升室温预热的YIJI缓冲液（Reagent A），混匀
• 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长540nm或440nm）：获得0分钟初始读数（Initial A540）
• 动态测读1分钟或室温下静置1分钟
• 即刻加入10微升YIJI诱导液（Reagent B）或用户自备的待测诱导剂，混匀（注意：可以设定不同浓度梯度）
• 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长540nm或440nm）：动态记录10分钟吸光值变化或设定时间点记录实际吸光值――吸光值降低，表明诱导膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常
• 计算吸光值比值（A540/Initial A540）：设定时间点实际吸光值/0分钟吸光值――吸光值比值降低，表明诱导膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常
• 构建膜通道孔诱导开放曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为时间（秒）
• 或构建膜通道孔诱导开放-药物浓度关系曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为药物浓度

• 抑制剂检测

• 准备好待测的纯化线粒体样品
• 移取20微升线粒体样品（总量为200微克）到比色皿或96孔板的对应孔里
• 加入160微升室温预热的YIJI缓冲液（Reagent A），混匀
• 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长540nm或440nm）：获得0分钟初始读数（Initial A540）
• 动态测读1分钟或室温下静置1分钟
• 加入10微升YIJI抑制液（Reagent C）或用户自备的待测抑制剂，混匀（注意：可以设定不同浓度梯度）
• 动态测读2分钟或室温下静置2分钟
• 即刻加入10微升YIJI诱导液（Reagent B），混匀
• 即刻放进分光光度仪或酶标仪（波长540nm或440nm）：动态记录10分钟吸光值变化或设定时间点记录实际吸光值――吸光值不变，表明抑制膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常
• 计算吸光值比值（A540/Initial A540）：设定时间实际吸光值/0分钟吸光值――吸光值比值不变，表明抑制膜通道孔开放活性（MPTP）增强，即膜通道孔功能正常
• 构建膜通道孔诱导开放曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为时间（秒）
• 或构建膜通道孔诱导开放-药物浓度关系曲线：纵座标（Y）为实际吸光值或吸光值比值（A540/Initial A540），横座标（X）为药物浓度

注意事项

• 本产品为20次操作
• 本产品用于膜通道孔的功能检测、以及诱导剂和抑制剂筛选
• 操作时，须戴手套
• 使用时，避免污染母液，尤其是YIJI缓冲液（Reagent A）
• 线粒体样品中忌用磷酸盐、EDTA、钙镁离子等处理
• 建议使用未经诱导或抑制处理的样品作为阴性对照
• 可以动态检测10分钟或30分钟  
• 可以使用540nm波长的滤波器或者440nm波长的滤波器 
• 可以使用分光光度仪检测，0.2毫升比色皿替代96孔板
• 540nm波长的0分钟读数通常0.8为理想状态；而440nm波长的0分钟读数通常0.2为理想状态；其吸光读数取决于线粒体的浓度
• YIJI诱导液（Reagent B）加入后的任一检测时间读数低于加入前读数表明膜通道孔开放
• 如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则吸光读数缓慢降低
• YIJI诱导液（Reagent B）含有氯化钙，用户可以使用其它诱导剂替代，例如磷酸盐，二氧化钾等
• YIJI抑制液（Reagent C）含有EGTA，用户可以使用其它抑制剂替代，例如环胞素A，ADP等
• 本公司提供通用型膜通道孔抑制剂：GENMED 0.2毫摩尔环胞素A（cyclosporine A）－GMS12226
• 诱导或抑制再诱导检测参考图像如下

• 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感

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