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新闻动态

苯并芘(BaP)酶联免疫分析(ELISA)说明书

点击次数:716 发布时间:2016-06-02

1 苯并芘(BaP)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 1 使用目的: 本试剂盒用于鱼、虾和肉类组织(如鸡、牛肉和猪肉),植物油等中苯并芘(BaP)残 留的定量检测。 2 实验原理 本试剂盒采用竞争 ELISA 方法,在微孔板包被有苯并芘(BaP)偶联抗原,加入苯并芘 (BaP)标准品或样品,游离苯并芘(BaP)与微孔条上预包被的苯并芘(BaP)偶联抗原互 相竞争抗苯并芘(BaP)抗体酶标记物,用 TMB 底物显色,加入终止液后颜色由蓝色变为 黄色,用酶标仪在 450nm 波长下进行检测,吸光值与样品中苯并芘(BaP)含量成反比,通 过标准曲线计算样品中苯并芘(BaP)的含量。 3 试剂盒组成 3.1 预包被的苯并芘(BaP)偶联抗原的可拆酶标板:1 块(12 孔×8 条)。 3.2 苯并芘(BaP)标准品:6 瓶(1ml/瓶),含量分别是: 0 ppb,0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。 3.3 抗苯并芘(BaP)抗体酶结合物:1 瓶(6ml)。 3.4 显色液 A:1 瓶(6ml)。 3.5 显色液 B:1 瓶(6ml)。 3.6 终止液:1 瓶(6ml),2M 硫酸。 3.7 样本稀释液:1 瓶(10×, 6ml),用于样品稀释用。 3.8 浓缩洗涤液:1 瓶(20×,20ml),用于洗板。 3.9 说明书一份。 4 需要而未提供的材料 4.1 设备 4.1.1波长450nm酶标仪。 4.1.2粉碎机。 4.1.3量筒。 4.1.4振荡器。 4.1.5漏斗。 4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。 4.1.7微量移液器。 4.2 试剂 4.2.1去离子水或蒸馏水。 4.2.2 甲醇。 5 贮存 5.1 试剂盒贮存于2~8℃,切勿冷冻 5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存 6 注意事项 6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。 2 6.2 不要使用过期试剂盒。 6.3 试剂盒使用前,将试剂恢复至室温(25±2℃),建议至少回温2小时。 6.4 标准品中含有苯并芘(BaP),使用时应特别注意,操作时应带手套。 6.5 终止液中含有硫酸,使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。 6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用,否则会影响试验结果。 6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用;不同标准品、样品所用吸头不得混用,否则会影响 实验结果。 6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液,否则会影响实验结果 6.9 混合试剂时应避免起泡。 7 工作液准备 7.1 苯并芘(BaP)标准品溶液:0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb 7.2 浓缩洗涤液:用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用 7.3 样本稀释液:用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用 7.3 显色剂:已备用,避免光线直照 7.4 反应终止液:已备用 8 样品处理程序(样品在提取过程中,要严格按说明书操作,提取过程中应准确稀释,否则 会出现结果不准确,样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存) 8.1取10g粉碎的样品,加 20ml 70%甲醇溶液 8.2强力振荡3分钟 8.3用Whatman No 1滤纸过滤 8.4取25µl处理后的样品,加入25µl样本稀释液于反应孔中(样本稀释倍数为2) 9 酶免分析步骤 9.1 实验须知 9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温(25±2℃),时间约2小时。回温至室 温(25±2℃)后再取出微孔条,多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存 注:一定保证回温充分,否则影响检测的度和准确度。 9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存 9.1.3 请不要改变分析程序 9.1.4 请使用的微量移液器 9.1.5 操作一旦开始,请不要中断任何程序 9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序,请严格按照要求操作 9.1.7 为避免交叉污染,每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样 9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面 9.2 分析步骤 9.2.1 预先进行编号,标记B0、标准品和样品的位置,推荐进行双孔检测 9.2.2 取所需数量的微孔(微孔条可拆),将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存 9.2.3 样品稀释液(10×)、浓缩洗涤液(20×)稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释) 9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ ml标准品溶液 9.2.5 在各标准孔中加入50µl的标准品溶液 9.2.6 在各样品孔中加入50µl样品溶液 9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗苯并芘(BaP)抗体酶结合物 9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。 9.3 37℃温浴30min (温浴过程中不时轻拍反应板,可以减少双孔误差) 9.3.1 甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板5次,zui后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液 3 体。 9.4 反应 9.4.1 洗涤程序完成后,立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A,再加 50µl显 色液B;轻微晃动反应板使之彻底混匀 9.4.2 37℃温浴10min 9.4.3 每孔中加入50µl终止液,混匀 9.4.4 在450nm下检测吸光度,结果在5min内读取。 10 结果计算 10.1定量分析 10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以*个标准(0标准) 的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值 10.1.2以苯并芘(BaP)浓度的对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。根据 样品百分吸光度值,可从曲线上得到对应点的横坐标,即为苯并芘(BaP)浓度的对数值, 求得反对数即为测定液中苯并芘(BaP)浓度C(ppb) 10.1.3由于样品经过了预先稀释,因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释 倍数。 10.2 半定量测定 10.1.1目测半定量测定:首先选择一个适当的标准液与样品同运行,根据样品与标准品吸光 度值的高低比较,判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 10.1.2仪器半定量测定:首先选择一个适当的标准液与样品同运行,根据样品与标准品颜色 深浅比较,判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 11 特异性 物质 交叉反应 苯并芘(BaP) 100% 12 试剂盒参数 本试剂盒检测下限为0.05ppb B0吸光度zui佳值应大于1.0 试剂盒吸光度板内误差小于8%,板间误差小于15%。 用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80%。 13 试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.1ppb。 14 分析限制 本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。

 
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