动物细胞高纯高尔基体分离试剂盒产品说明书

YIJI动物细胞高纯高尔基体分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI动物细胞高纯高尔基体分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理、差速和等密度离心方法，从动物细胞中分离出活性完整而高度纯化的高尔基细胞器组分的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。适合于各种动物细胞，包括人体细胞等的高尔基体的制备。可以被用于受体循环、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗体释放机制等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量高。

技术背景

高尔基体（Golgi apparatus或Golgi bodies），又称为高尔基复合体（Golgi complex），是一种细胞器，存在于大多数真核生物细胞中。高尔基体由扁平膜结合的高尔基堆（stacks），即小池（cisternae）组成，约有4至8层，分成3个功能区：顺面、中层、反面等，进一步地构成细胞膜、分泌泡、内涵体等。高尔基体整合各种大分子进行加工、分类和包装，然后分门别类地送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。高尔基体参与糖蛋白质的糖基化、碳水化合物的合成、蛋白质的分泌、膜转化、溶酶体形成的细胞活动。高尔基体的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：*，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得高尔基体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的高尔基体。 

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI净化液（Reagent C）   毫升

YIJI活性液（Reagent D）   微升

YIJI强化液（Reagent E）   毫升

YIJI保存液（Reagent F）   毫升

YIJI高纯液（Reagent G）   毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存YIJI净化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（YJ12028）或PBS缓冲溶液（YJ12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（YJ12052）：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

6毫升超速离心管：用于超高速离心的容器

4℃台式离心机：用于样品制备

4℃超速离心机：用于样品制备

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

试管固定支架：用于离心管固定支撑

3号针筒和18号针头：用于收集样品

实验步骤

• 组织匀浆法

实验开始前，将试剂盒里的YIJI净化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）冻融，然后移出移取xx微升YIJI活性液（Reagent D）、 xx毫升YIJI净化液（Reagent C）到xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 重复实验步骤2一次
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
• 置入37℃培养箱3分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
• 分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入一个15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项7）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• （选择步骤）放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• （选择步骤）小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为10000g
• 小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——此步骤获得后线粒体组分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得微粒体组分
• 即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混匀沉淀物
• 加入xx毫升YIJI高纯液（Reagent G），混匀
• 放进4℃超速离心机离心2小时30分钟，速度为365000g
• 小心取出超速离心管：可见顶端和中端处（高尔基体样品带）和底端处（内质网样品带） 
• 小心收集顶端和中端处高尔基体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯高尔基体样品
• 加入xx至xx毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），混匀
• 放进－70℃冰箱里保存
• 化学处理法

实验开始前，将试剂盒里的YIJI净化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）冻融，然后移出移取xx微升YIJI活性液（Reagent D）、xx毫升YIJI净化液（Reagent C）到xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为YIJI裂解工作液。然后进行下列操作。

• 准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 重复实验步骤2一次
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
• 置入37℃培养箱3分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
• 分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入一个15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液管
• 加入预冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入预冷的xx微升YIJI强化液（Reagent E）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
• 加入预冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B），轻轻摇动试管混匀
• （选择步骤）放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• （选择步骤）小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为10000g
• 小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——此步骤获得后线粒体组分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放进4℃超速离心机离心60分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得微粒体组分
• 即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混匀沉淀物
• 加入xx毫升YIJI高纯液（Reagent G），混匀
• 放进4℃超速离心机离心2小时30分钟，速度为365000g
• 小心取出超速离心管：可见顶端和中端处（高尔基体样品带）和底端处（内质网样品带） 
• 小心收集顶端和中端处高尔基体样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯高尔基体样品
• 加入xx至xx毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为100000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），混匀
• 放进－70℃冰箱里保存

注意事项

• 本产品为10次（5 X 107细胞）操作
• 操作时，须戴手套
• 操作时，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent F）
• 所有操作均须在4℃或以下状态进行
• 建议使用足够的样品量
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒块消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
• 对于难以裂解的细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
• 通常5 X 107细胞的高尔基体含量为15微克蛋白

11． 本产品所获得的高尔基体纯度达95%以上

12． 高尔基体的标志蛋白是UDP半乳糖基转移酶（UDP-galactosyl transferase）；建议使用YIJI纯化高尔基体UDP半乳糖基转移酶活性比色法定量检测试剂盒－YJ50414.3

• 本公司提供系列亚细胞结构分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离的高尔基体维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶