活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

YIJI 活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
YIJI 活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂是一种旨在通过钙黄绿素－钴技术，选择性地
聚集在线粒体内呈现荧光染色，而存在于或由线粒体释放到细胞浆的荧光染料，即刻发生荧光淬灭，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞线粒体（动物、人体、昆虫等）膜通道孔活性（瞬时或长期开放状态）的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。
技术背景
线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的开放，显著改变线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素 C 的释放和线粒体膜电位的消失。钙黄绿素－AM，又称双甲亚胺二酸钠荧光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis－carboxymethyl amino methyl fluorescein）－acetoxymethyl ester】，作为荧光探针：*，适宜的分子量 622kd，小于1.5kd；第二，几乎不具有膜结合性；第三，不是线粒体酶的底物；第四，容易进入细胞及其线粒体。钙黄绿素-AM 进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生具有极性的荧光性强的钙黄绿素。钙黄绿素进入线粒体后，被线粒体俘获。同时胞浆内的钙黄绿素受到其淬灭剂钴离子的淬灭。一旦线粒体膜通道孔瞬时开放，钙黄绿素释放出来，被钴离子淬灭。线粒体内钙黄绿素荧光的变化，表明膜通道孔的开放状态。
产品内容
YIJI 清理液（Reagent A）     毫升
YIJI  染色液（Reagent B）    微升
YIJI  中和液（Reagent C）    毫升
产品说明书                   1份
保存方式
保存YIJI染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里;有效保证6月
用户自备
24 孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器
1.5 毫升离心管：用于染色工作液配制和细胞染色的容器
微型台式离心机：用于沉淀细胞
培养箱：用于染色孵育
（共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析

荧光分光光度仪或酶标仪：用于细胞荧光定量分析
细胞流式仪：用于细胞荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的YIJI染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI中和液
（Reagent C）放进 37℃恒温水槽里预热。然后移出毫升离心管，加入暗室里。然后进行下列操作。
一、 贴壁细胞染色
1． 准备 1 个细胞培养 24 孔板的待测细胞（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和其微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新的 1.5微升 YIJI 中和液（Reagent C），混匀后，标记为 YIJI 染色工作液，置入它培养孔板，见注意事项 8）
2． 小心抽去细胞培养液
3． 小心沿着孔壁加入
养孔表面
4． 小心抽去清理液
5． 小心沿着孔壁加入
微升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 中和液（Reagent C）的
YIJI 染色工作液到 1 个细胞培养孔，覆盖培养孔表面
6． 放进 37℃细胞培养箱里孵育 20 分钟，避免光照
7． 小心抽去 YIJI 染色工作液
8． 小心沿着孔壁加入
9． 小心抽去清理液
10． 重复实验步骤 8 和 9 一次
11． 小心沿着孔壁加入 500 微升 37℃预热的 YIJI 清理液（Reagent A）到细胞培养孔
12． 选择下列方式之一进行操作：
（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：
激发波长 488nm，散发波长 505nm――绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
（B）
增强
二、 悬浮细胞或脱离细胞染色
1． 将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 106 细胞）移入到 1.5 毫升离心管
2． 放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
3． 小心抽去上清液
4． 加入
微升 37℃预热的 YIJI 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
5． 放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
6． 小心抽去上清液使用荧光酶标仪检测（定量检测）：
微升 37℃预热的 YIJI 清理液（Reagent A）到细胞培养孔
微升 37℃预热的 YIJI 清理液（Reagent A）到 1 个细胞培养孔，覆盖培放进荧光分光光度仪：激发波长 488nm，散发波长 505nm――RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）
7． 加入微升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和YIJI 中和液（Reagent C）的 YIJI 染色工
作液，充分混匀

8． 放进 37℃细胞培养箱里孵育 20 分钟，避免光照
9． 放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
10．小心抽去上清液
11．加入微升 37℃预热的 YIJI 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
12．放进微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g（或 2000RPM，例如 eppendorf 5415）
13．小心抽去上清液
14．重复实验步骤 11 至 13 一次
15．加入微升 37℃预热的 YIJI 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
进行细胞流式仪分析（每隔 5 分钟检测一次，持续 30 分钟） 波长 488nm 氩离子激光，：观察 50000个细胞以上――
波峰左移，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
b)或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
16．选择下列方式之一进行操作：
1）移取 10 微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片（每隔 5 分钟检测一次，持续 30 分钟）
2）激发波长 488nm，散发波长 505nm――
绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
c)或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：
1）移取 500 微升上述细胞悬液到 1 毫升比色杯
2）加入 500 微升 YIJI 清理液（Reagent A）
3）上下倾倒混匀数次
4）放进荧光分光光度仪（每隔 5 分钟检测一次，持续 30 分钟） 激发波长 488nm，：散发波长 505nm――
RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强
注意事项
1． 本产品为 20 次（0.5 毫升体系/次）操作
2． 所有操作均须无菌状态下进行
3． 操作时，须戴手套
4． 染色前，所有试剂溶液，除 YIJI 染色液（Reagent B）外，需 37℃预热
5． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析
6． 孵育时，必须避免光照
7． 本产品友好使用于双重染色或重叠染色
8． 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和各种培养孔板，须相应调
整处理液：
操作容器          建议操作体系
载玻片            100 微升
载玻片培养皿       1 毫升
35mm 培养皿        1 毫升
96 孔培养板        100 微升
48 孔培养板        200 微升
24 孔培养板        500 微升
12 孔培养板        1 毫升
6 孔培养板         2 毫升
25cm2 细胞培养瓶   3 毫升
9． 如果不具备 505nm 散发波长的滤波器，可以使用 505nm 至 530nm 中的任一波长
10．如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则荧光缓慢且自发降低
11．本公司提供膜通道孔抑制剂：YIJI 0.2 毫摩尔环胞素 A（cyclosporine A）－GMS12226，维护荧光完整
12．本公司提供系列线粒体分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定荧光清晰