荧光免疫技术基本原理

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展zui早的一种，始创于20世纪40年代初，由Coons等用异氰酸荧光物质标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。至20世纪50年代末期，Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄（fluorescelnisothioeyanante，FITC），并由Marshall等对荧光抗体的标记方法进行了改进，从而使荧光免疫技术逐渐推广应用。20世纪70年代以来，在传统荧光抗体技术的基础上，根据放射免疫和酶免疫测定的原理，发展建立了各种免疫荧光测定法，可用于定量测定体液中抗原或抗体。近年来由于免疫学各个领域的发展，在临床检查工作中免疫荧光技术已逐渐突出，如自身抗体的检测，B细胞、浆细胞的功能探索等皆获得了广泛的应用。

免疫荧光检测法是以荧光物质（也称为荧光色素或荧光素）作为标记物，标记抗体（或抗原），与相应的抗原（或抗体）反应，根据荧光的存在与否来检测其是否存在。在实际工作中，用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以也称之为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。

荧光是由荧光物质的分子吸收外界能量（如光能等），发生电子跃迁，而后以光子的形式释放出能量，停止能量供给，发光亦立即停止。这个过程中将损失部分能量，因而释放的光子比激发光的波长长，二者波长之差反映了荧光物质的特征，称为“stokes改变”。此外，荧光没有指向性，因而可在任意方向置放检澜器，而不一定在激发光的直线上。

荧光素是一种有机染料，用于抗体标记的荧光素具有以下特点：①通常是环状复合物，与延伸物相连接。单键与双键的交替数目越大，被激发的分子稳定性越大，即荧光增强。②分子平面性和硬度越大，荧光倾向越大。③有些分子尤其是螯合物，加入金属离子可产生强烈荧光。④浓度、温度、PH值和离子强度均可对分子的荧光效率产生显著影响。荧光物质的稀释溶液，可在室温下使用。荧光可采用常见的、相对较便宜而无害的方法来检测。此外，结合物在一般储存条件下性能稳定，可保存使用较长时间。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（tetraethlrodamine B200，RB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（tet—ramethyl rhodamine isothio-cyanate，TRITC）÷镧系稀土元素螯合物、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）及7—氨基—4—甲基香豆素（7—amino-4—methyl couma-rin，AMC>等。其中FITC应用zui广，罗丹明、PE和AMC常与FITC联合使用，作为对比染色或双标记，特别是PE在流式细胞术（flowcytometry，FCM）中较常用。

与紫外可见分光光度法不同，荧光过程是一个主动的过程，其荧光强度依赖于供能的强度，即样品荧光信号强度与激发信号强度成正比。如果激发信号增强，则荧光信号也增强，因而，采用高强度的光源可大大增强荧光技术的敏感性。这也是荧光检测法比吸收检测法更敏感的原因之一。