研究人员对抗原修复存在的问题和克服方法的讨论

高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题不可能用设计对照的方法加以解决。有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但石蜡切片用抗原修复后却能很好地显示。对某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过修复后，绝大部分表达在核内，例如p185、Bcl—2、P-gp和nm23；而有些表达在核内的抗原经过修复会出现在胞浆内，例如p53、PCNA、ki-67和细胞周期素等。因此在使用该方法时一定小心，对结果的判断也要客观地作出分析。

某些商品化抗体因自身抗体质量的问题，在石蜡切片上无论用什么方法，抗原怎么修复都无法显示阳件结果；还有些抗体在阳性对照切片上有阳性结果，或文献报道应该有阳性结果，或从玛论上讲应该会有阳性结果，但检测结果为阴性结果。这导致操作者或研究者在抗原修复方式上和抗原修复介质上进行多种尝试，力图使该抗原出现在某些部位，结果可能仍然为阴性结果、或阳性很微弱、或假阳性结果（定位不准确，一片淡染阳性结果）。出现上述现象首先应该与厂商，或更换抗体或退货，否则其结果是不可靠的，其次应从组织的固定和方法的选择上再认真查找原因。

在20世纪的60年代一80年代，人们在利用生物素—亲和素（抗生物）组成的亲和细胞化学技术以来，已发现在正常的哺乳类动物和人体细胞内存在内源性生物素，以肝、肾、乳腺和脂肪组织内含量较高，但在人体的皮肤、淋巴结和脾脏冷冻组织中未检测到内源性生物素。1994年Cauli等发现人体唾液腺导管上皮细胞存在内源性生物素，1997年Rodriguezso—t。等发现甲醛固定、石蜡包埋的肾脏和肝脏组织中没有内源性生物染色，但该组织用o．01mol／LpH6．0 CB抗原修复后出现了内源性生物素的干扰，表明热修复可使甲醛固定和石蜡包埋所遮盖（mask）的内源性生物素重新暴露。国内周小鸽等也已证实在人体几乎所有的正常组织大量的肿瘤组织和动物组织中存在内源性生物素，尤其是上皮性肿瘤zui明显。

生物素是一种维生素，相对分子质量为244．3，来自食物和肠道细菌合成，在人体内主要存在于线粒体和细胞质中，它是多种羧化酶的辅酶，参与糖异生和脂肪酸合成反应。因此，代谢旺盛的富含线粒体的细胞，如大多数上皮源性细胞，有较多的内源性生物素显现。由于大多数肿瘤细胞含有丰富的线粒体，因此，肿瘤细胞易出现内源性生物素阳性反应（假阳性）。这些假阳性反应极易被当作特异性反应看待，从而出现误判。如果见到胞质中有阳性的棕色颗粒，应考虑到内源性生物素的干扰，并应进一步确证。

消除内源性生物素的zui有效、zui简单的办法就是不用ABC、S-P（LsAB）法，改用En—Vision等方法。另一种办法就是在热修复后，一抗前或一抗后用20％蛋清（20ml蛋清+gOml蒸馏水）于37℃封闭30min，效果非常理想。