琼脂糖凝胶电泳制备方法及核酸检测

一. 实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;

2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

二. 实验原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。

溴化乙锭（EB）未扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。

三、仪器和试剂

仪器： 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉

试剂： 琼脂糖：1.0%；电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ） EB：5 ?l / 100 ml TBE

电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）

四. 操作步骤

（1）制胶（以20 mL为例）

a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的1XTAE缓冲液（pH 8.0），摇匀；

b. 微波炉加热，至琼脂糖wan全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；

c.将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；

d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。

（2）点样

用微量移液器将5 ?l含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。

（3）电泳

打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。

（4）观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

五、实验结果

点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮，条带粗细均匀；条带没有出现两端粗中间细的情况