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3H-TdR掺入法检测IL-2的生物活性

点击次数:914 发布时间:2012/5/15
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【材料和试剂】
(1)         反应细胞:CTLL-2,存活率应>95%。
(2)         IL-2标准品:倍比稀释为不同浓度。
(3)         待测样品:倍比稀释为不同浓度。
(4)         10% Fcs-RPMI-1640完全培养液
(5)         3H-TdR
(6)         96孔培养板,刻度吸管,毛细吸管,刻度离心管,离心机,加样器(头),细胞计数板,倒置显微镜,超净工作台,CO2培养箱,微量细胞收集仪,玻璃纤维滤纸,ß液闪计数仪。
【操作步骤】
(1)   用10 %FCS-RPMI-1640培养液洗涤CTLL-2细胞2次,1000r/min离心5min,以去除原生长培养液(含IL-2);
(2)   用10% Fcs-RPMI-1640培养液调细胞浓度为1×105/ml;
(3)   将不同倍比稀释度的IL-2的标准品和待测样品分别加入96孔细胞培养板,100μL/孔,各设3复孔,同时设培养液对照;
(4)   各孔均加入CTLL-2细胞悬液,100μl/孔 ;
(5)   置37℃,5%CO2培养箱中培养24h;
(6)   每孔均加入3H-TdR,0.5μci/孔  ,继续培养4-6h;
(7)   用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上,用ß液闪计数仪测定各孔cpm值。测定CPM值的zui佳时间应是培养液对照(无IL-2)细胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔细胞生长旺盛时。
【结果分析】
(1)         每孔cpm值为了复孔的平均值,再减去培养液对照,即为各孔zui终c
(2)         计算IL-2活性单位(参见IL-1、IL-2的MTT比色检测法)可按下式计算:
 

样品IL-2活性单位
(U/ml)
=
达50%zui大增殖3H-TdR渗入值的样品稀释度
×
标准品IL-2活性单位
(U/ml)
达50%zui大增殖3H-TdR渗入值的标准品稀释度

 
【注意事项】
(1)   用125I-UdR代替3H-TdR进行IL-2活性检测。其优点是不需ß液体闪烁测定所需的试剂和设备,只需一台小型γ计数仪即可,并可节省时间和减少ß液体闪烁操作中出现的误差。其缺点是125I-UdR半衰期较短,需要定期供应。基本方法同3H-TdR掺入法,只是用125I-UdR代替3H-TdR,0.2μci/孔  ,然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl,继续培养24h,收集细胞用γ计数仪测定cpm值。
(2)   其余注意事项可参见MTT法检测IL-2活性部分。

 

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